《灵芝的栽培与实验研究》 | 第一篇 灵芝的栽培 2 灵芝母种的制备

灵芝种源可以从菌种保藏机构购买，也可以直接从野生灵芝中分离，经栽培驯化，提纯而成灵芝菌种。在现代灵芝研究中国，通常为开发本地灵芝资源，多采用野生灵芝分离。灵芝菌种的分离方法有组织分离、孢子分离法及基质内菌丝分离法3种方法。基质内菌丝分离因易污染较少采用；孢子分离法多在研究及菌株复壮时采用；规模生产所用菌种多采用子实体菌丝分离法，该方法操作简便，且能保持原有菌株的优良品性。

2.1培养基配制

2.1.1培养基配方

（1）PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。

（2）综合马铃薯培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL。

（3）马铃薯麦麸综合培养基：马铃薯（去皮）200g，麦麸100g，葡萄糖20g，磷酸：二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL。

（4）马铃薯酵母粉综合培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉4g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL。

2.1.2培养基的制作流程

材料选择→准确称量→加热提取→配制定量→分装→调pH值→灭菌（121℃、30min）→斜面摆放（培养基长度为试管长度的2/3）。

2.1.3 PDA培养基制备方法

称取去皮、切片的马铃薯200g，置于锅内，加入水1000mL，煮至薯片软而不烂。用4~6层纱布过滤，取滤液。向滤液中加入琼脂20g，继续煮沸至琼脂完全融化，加入葡萄糖20g，补水至1000mL。趁热分装于试管中，装至试管长度的1/5~1/4，擦净管口，塞上棉塞或者硅橡胶塞。棉塞力求大小规范，松紧适中，不能出现缝隙。然后，在0.11MPa、121℃条件下灭菌30min。灭菌后趁热摆放斜放试管，根据实验室条件使用合适的工具使培养基前端蔓延至试管长度1/2，盖上纱布或灭菌的报纸（防冷凝水过多），待培养基凝固（静置24h）后，取3~5支试管置于30℃培养3d，若无杂菌出现，表明灭菌彻底，可供接种用。

2.2菌种的分离与培养

2.2.1组织分离法

灵芝子实体的不同成熟阶段及子实体的不同部位上，其细胞大小，内含物（原生质、细胞器）多少及分化程度是不同的。幼小的子实体和长大的子实体，其细胞数量相差很小，而细胞大小相差很大，成熟子实体的细胞明显大于幼小子实体的细胞。子实体长孢子前，细胞大，原生质含量较多。用这种细胞萌发的菌丝生命力强，抗性好。灵芝菌丝和子实体很容易纤维化，纤维化的细胞空腔很大，细胞质、细胞器含量比幼嫩子实体细胞还少。所以，灵芝组织分离时，灵芝的组织分离应该在子实体即将成熟的时候分离效果比较好。选取形态发育正常、刚开始开片，子实体刚出现橘黄（开始纤维化）、无病虫害、未弹射孢子的灵芝子实体，菌盖边缘尚在生长的黄白色子实体分离。分离部位应选在菌柄基部和菌盖边缘之间的中间部位，即选取在中部菌管的上方而不是选取在菌柄和菌盖交叉的位置。组织分离时所用割刀必须锋利，一刀割下就应把其分开，切忌反复用力撕拉，伤害组织。接种针火焰灭菌后要冷却后方可使用。接种块大小为0.3cm左右，不要太大，也不要太小。在无菌条件下用0.1%二氯化汞水溶液（升汞水）或用70%~75%酒精进行表面擦拭消毒。切去菌柄基部，在菌盖中部，用单面刀片或解剖刀切取米粒大菌肉一块置入新鲜的试管斜面培养基中央。可多分离一些试管，以供选择。试管置26~28℃恒温箱内，培养2~3d即可见菌肉上有少量白色棉絮状菌丝长出，7~8d后菌丝可长满斜面，选取灵芝菌丝生长旺盛、均匀、洁白的试管作为试验和生产用的菌种，通常称此为第一代母种试管，可保存在冰箱中供转管使用。

2.2.2孢子分离法

灵芝孢子粉是灵芝发育后期弹射释放出来的种子，生物学上称担孢子，集中起来后呈粉末状，通称为灵芝孢子粉，它的利用和研究是近几年来新发现的，每个灵芝孢子只有4~6μm，是活体生物，外被坚硬的纤维素外壁。

它凝聚了是灵芝的精华，具有灵芝的全部遗传物质和保健作用。进行孢子分离时首先要取发育正常、健壮、已开始弹射孢子的灵芝子实体。切除菌柄，无菌条件下用0.1%升汞水或75%酒精进行表面消毒，用无菌水多次冲洗，再用无菌棉擦拭干净。将菌管朝下放在经灭菌的培养皿内，外罩以用75%酒精擦拭过的玻璃罩，在25~30°C条件下经过5~6h后孢子散落在培养皿底部，用接种针挑取少量孢子放入试管斜面培养基中部，移至培养箱中进行培养。分离用的培养基可采用普通马铃薯培养基、麸皮提取液培养基等。

孢子分离法污染率较高，应及时检查并去除被杂菌污染的试管。待孢子萌发出菌丝时，应连同少量培养基挑出及时移管。可将子实体切成蚕豆大的种块，用无菌铁钩固定后置三角瓶中，瓶底有lcm厚培养基，塞上棉塞。见孢子弹射后并萌发出菌丝时及时移管。野外分离灵芝孢子时因条件限制，可将菌肉（带菌管）贴在试管壁上，待孢子弹射人培养基后及时转管。孢子萌发后先形成一级菌丝，几天后便可形成二级菌丝。如果在显微镜下观察到锁状联合，一般即可确定为得到了灵芝菌丝。

2.2.3基质内菌丝分离法

利用灵芝生长的培养的基质作为分离材料获得灵芝菌种的一种方法，它仍属于无性繁殖，其优点是在灵芝子实体已衰老时仍可以获得灵芝纯菌丝体。但是，在子实体生长时，基质内的灵芝菌丝体不是单独存在的，常与多种微生物（如细菌、放射菌、霉菌及其他真菌）生长在一起，给分离增加了困难，且灵芝子实体生长时间较长，一年的春夏秋均会发生，取材比其他食用菌简单，且子实体存放时间较长，因此基内菌丝分离法在灵芝中很少应用。只有在进行灵芝资源调查，或选用野生种进行驯化时，灵芝子实体已释放完孢子和老熟无法进行孢子分离或组织分离的情况下才采用。为获得纯灵芝菌丝体，分离时注意分离材料的选择。选长有灵芝子实体，菇木尚未腐烂的作为分离材料，无裂褶和其他多孔菌等生长的枯木或树根，常用水冲洗去泥沙、杂质。摘去灵芝子实体，并从长子实体两边锯断，若芝木较粗用刀纵劈成数块。在无菌条件下，用75%酒精擦拭消毒，将带柄基部分置酒精灯火焰上燃烧，用手术刀削去表皮，每削一次均需燃烧1次，以防交叉感染，然后将长有白色菌丝的切削面切刮下微小的木片或颗粒，用接种工具移至新鲜的PDA培养基上，28℃下避光培养，见培养基中有白色菌丝生长并长满培养容器停止培养并保存。

3种方法分离得到菌丝体若要作为菌种使用，则要挑选灵芝菌丝体生长整齐，长速正常，菌丝外观饱满，长势旺盛，气生菌丝洁白、纤细、平坦、致密、均匀的分离物作为备用菌种。这种直接以野生分离灵芝菌种需经研究机构的栽培试验、成分分析，所以一般芝农若要进行生产经营应从具有较强科研技术实力、信誉良好的专门科研机构引种，或从灵芝经营专业公司引种比较可靠。

本章参考文献

[1]池小妹，我国灵芝人工栽培技术研究现状[J]，时珍国医国药，2005，16（8）：791-792.