农业技术｜高致病性禽流感诊断技术规范

一、流行病学

（一）传染源。主要为病禽（野鸟）和带毒禽（野鸟）。病毒可在污染的粪便、水等环境中存活较长时间。

（二）传播途径。主要为接触传播和呼吸道传播。感染禽（野鸟）及其分泌物和排泄物，污染的饲料、水、蛋托（箱）、垫草、种蛋、鸡胚和精液等媒介以及气溶胶，都可传播禽流感病毒。

（三）易感动物。鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、孔雀等多种禽类易感，多种野鸟也可感染发病。

（四）潜伏期。病毒毒力、家禽免疫情况、品种和抵抗力、饲养管理和营养状况、环境卫生及应激因素等都会影响潜伏期。潜伏期可从数小时到数天，最长可达21天。世界动物卫生组织《陆生动物卫生法典》将高致病性禽流感的潜伏期定为21天。

（五）发病率和病死率。与宿主、感染毒株和禽群免疫状况等因素密切相关，最高可达100%。

（六）季节性。没有明显的季节性，但冬春多发。

二、临床表现

（一）饮水量异常变化、采食量下降。

（二）精神沉郁，嗜睡，可见扭颈等神经症状；呼吸困难，有呼吸道症状。

（三）冠髯发绀、发紫，脚鳞或有出血。

（四）产蛋突然下降，软壳蛋、畸形蛋增多。

（五）发病率高，发病急、死亡快。

（六）鸭、鹅等水禽可见腹泻和神经症状，有时可见角膜发红、充血、有分泌物，甚至失明。

三、剖检变化

（一）气管弥漫性充血、出血，有少量黏液；肺部有炎性症状；

（二）腹腔有浑浊的炎性分泌物；肠道可见卡他性炎症；输卵管内有浑浊的炎性分泌物，卵泡充血、出血、萎缩、破裂，有的可见卵黄性腹膜炎；胰腺边缘有出血、坏死；

（三）心冠及腹部脂肪出血；腺胃肌胃交界处可见带状出血，腺胃乳头可见出血；盲肠扁桃体肿大出血；直肠黏膜及泄殖腔出血。

急性死亡家禽有时无明显剖检变化。

四、实验室诊断

（一）样品的采集、运输和保存。尽量在发病初期采集具有典型临床症状的禽只样品。采样过程中应避免交叉污染，并规范填写采样登记表。

1. 血清样品的采集。无菌采集禽类的血液，每只约2 mL，编号并填写相应采样单。待血液凝固，血清析出后，收集血清用于血凝抑制（HI）检测。

2. 病原学样品的采集。活禽可采集咽喉和/或泄殖腔拭子样品，病死禽可采集气管、肺和脑等组织样品。

拭子样品。取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮2～3次并旋转，取分泌液；取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便；将采样后的拭子分别放入盛有1.2 mL采样缓冲液的2mL采样管中，编号并填写相应采样单。

组织样品。发病禽可无菌采集气管、肺、脑、肠（包括内容物）、肝、脾、肾、心等组织脏器，装入无菌采样袋或其他灭菌容器，编号并填写相应采样单。

3. 样品保存、包装和运输。样品采集后置保温箱中，加入预冷的冰袋，密封，尽量24小时内送到实验室。样品的包装和运输应符合农业农村部《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》等规定。样品运抵后应尽快处理。病原学样品4℃存放不得超过4天，否则应在-70℃下保存；在样品保存过程中，应避免反复冻融；尽量避免在-20℃下保存。血清学样品在一周内能检测，则保存在4℃环境中，否则应在-20℃下保存。

（二）血清学检测。采用HI试验，检测血清中H5或H7亚型禽流感病毒血凝素抗体。HI抗体水平≥24，结果判定为阳性。

（三）病原学检测

1. 病原学快速检测。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或实时荧光定量RT-PCR等方法。

2. 血凝素基因裂解位点序列测定。对血凝素基因裂解位点的核苷酸序列进行测定，与高致病性禽流感病毒基因序列比对。

3. 病毒分离与鉴定。采用鸡胚接种或细胞培养分离鉴定病毒。从事高致病性禽流感病毒分离鉴定，必须经农业农村部批准。

4. 致病性测定。静脉内接种致病指数（IVPI）大于1.2或用0.2mL 1：10稀释的无菌感染流感病毒的鸡胚尿囊液，经静脉注射接种8只4～8周龄的易感鸡，在接种后10天内，能致6～7只或8只鸡死亡，即死亡率≥75%。

五、结果判定

（一）可疑病例。禽群发病率、死亡率超出正常范围，且符合下述标准之一的，判定为可疑病例。

1. 临床判断标准

（1）脚鳞出血。

（2）冠髯发绀，头部和面部水肿。

（3）产蛋突然下降，软壳蛋、畸形蛋增多。

（4）出现神经症状。

符合上述条件之一的，判定为符合临床标准。

2. 剖检病变标准

（1）消化道、呼吸道粘膜广泛充血、出血。

（2）心冠及腹部脂肪出血。

（3）卵泡充血、出血，可见卵黄性腹膜炎。

（4）腺胃肌胃交界处可见带状出血。

符合上述条件之一的，判定为符合剖检病变标准。

（二）疑似病例。对临床可疑病例，经市（地）、县级动物疫病预防控制机构实验室检测为H5或H7亚型禽流感病毒核酸阳性的，判定为疑似病例。

（三）确诊病例。对疑似病例，省级动物疫病预防控制机构经RT-PCR或实时荧光定量RT-PCR方法复核阳性，且测序证实含有高致病性禽流感病毒分子特征的病毒核酸或病毒分离鉴定为高致病性禽流感病毒的，可判定为确诊病例。